Se il plasmide ha due siti dello stesso tipo di enzima di restrizione. Se aggiungiamo quel tipo di enzima, taglieremo il plasmide in entrambi i siti o ne taglieremo uno solo?

Pensaci su piccola scala, hai una tonnellata di DNA che fluttua intorno a te con un mucchio di gli enzimi si mescolano. Tagliano qualsiasi cosa per cui hanno specificità e accadrà. Parte del DNA verrà tagliato una volta, due volte, ecc. Tutti questi frammenti apparirebbero in bande separate attraverso l'elettroforesi. Ma, supponendo una buona miscela e una reazione perfetta, tutti i siti verrebbero tagliati. Ad ogni modo, attraverso l'elettroforesi si può calcolare la dimensione dei frammenti.

Tl;Dr È importante, almeno per me, visualizzare la miscela (è tutto un casino impazzito su piccola scala)

Entrambi i siti. Posso attestarlo perché ho progettato un plasmide appositamente per farlo. Fondamentalmente ho inserito una breve sequenza di 30 bp lungo nel MCS affiancato da 2 siti di restrizione identici, in modo che possono essere entrambi tagliati su 1 capo con lo stesso enzima di restrizione al taglio. Gli enzimi sono estremamente efficienti, come con tutti gli enzimi di restrizione ingegnerizzati, quindi sarà quasi impossibile selezionare (se si desidera tagliare solo a 1) quale sito tagliare.

Se può vincolare il sito di restrizione, può tagliare – non importa se ce n'è uno o dieci, anche se il tempo sarebbe un fattore. Se lavori con il DNA plasmidico circolare, è piuttosto importante assicurarsi che non ci siano siti di restrizione imprevisti nella sequenza o potrebbe finire per distruggere il DNA con diversi tagli invece di linearizzarlo con un singolo taglio.

Entrambi i siti. A meno che l'enzima non sia molto efficiente in quelle condizioni / bassa concentrazione / intervallo di tempo molto breve, otterrai un mix di alcuni plasmidi non tagliati, alcuni con un singolo taglio e altri con entrambi i siti tagliati.